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虽然JC-1在许多线粒体膜电位检测实验中广泛使用，但是其低水溶性，使它很难用于一些研究中。即使在浓度为1μM，JC-1易于从含水的缓冲液中析出。JC-10是开发的一种可以在需要高浓度染料的实验中替代JC-1。与JC-1相比，我们的JC-10具有更好的水溶性。JC-10可以选择性的进入线粒体，并且由于膜电位的增加，其颜色会发生从绿色到橙色的可逆性改变。这种特性是由于JC-10聚合物的可逆结构，在膜极化条件下，它的发射光由520nm(JC-10单体发射光)转移到570nm (J-聚合体发射光)。当在490nm处激发时，JC-10发生从绿色到橙绿色的可逆改变，因为线粒体膜极化的更大。这两种颜色都可以被流式细胞仪上装好的一般滤光器检测到，因此绿色发射光可以通过荧光通道1（FL1）进行分析，橙绿色发射光可以通过荧光通道2（FL2）进行分析。不仅可用于流式细胞仪检测，也可用于荧光成像和荧光酶标平台。这个试剂盒基于检测细胞的线粒体膜电位变化的阳离子，亲脂性的JC-10染料。在正常细胞中，JC-10在线粒体基质中聚集，形成红色荧光聚集体。然而，在凋亡和坏死的细胞中，JC-10紧以单体形式存在，将细胞染成绿色。本试剂盒最适合用于通过流式细胞仪进行细胞凋亡激活剂和抑制剂的筛选，我们也提供能便捷地用于96和384孔板的荧光微孔板检测的试剂盒，用于高通量筛选。

• 准备细胞：
  细胞浓度在5×10⁵～1×10⁶/mL之间。
  
• 制备JC-10染料加载溶液
  
  • 使用前该试剂盒需要在室温解冻。
    注意：
    试剂A可分装后冻存于-20℃.避免反复冻融。
    
  • 将25μL的200×JC-10浓缩液（组分A）加入到5mL Assay Buffer (组分B)中，混匀。
• 操作步骤：
  注意：CCCP或FCCP可以同时加入JC-10染料加载溶液（来自步骤2b）中使用。特定的细胞系可能需要CCCP或FCCP的最佳滴定结果。
  
  • 用测试化合物在需要的时间内处理细胞以诱导凋亡实验。设置平行对照实验。
    对于阴性对照：只用vehicle处理细胞。
    对于阳性对照：用2～10μM的FCCP或CCCP处理细胞，37℃，5％ CO₂培养箱中进行15至30分钟。
    注意：对于贴壁细胞，用0.5mM EDTA轻轻吹起细胞保持细胞中的摄取，在用孵育JC-10染料加载溶液（见步骤3.c）之前用含血清的培养基洗涤细胞一次。
    
  • 离心收集细胞，每管2～5×10⁵个细胞。
    
  • 用500μL的JC-10染料加载溶液（来自步骤2b）重悬细胞。
    注意：根据特定的细胞类型和细胞浓度决定适当的孵育时间。对每个实验进行孵育时间优化。
    
  • 在室温下用染料加载溶液孵育细胞或在37℃，5％CO₂培养箱中孵育15～60分钟，避光。
    
  • 用流式细胞仪的通道FL1监测凋亡细胞的绿色荧光单体信号，通道FL2监测正常细胞的橙色荧光聚集体信号。设置阈值，去除杂质。建议使用FCCP或CCCP处理的细胞进行补偿校正。

• 对于活的非凋亡细胞，JC-10作为染成绿色胞质溶胶的单体存在，并且还累积作为骨料中染成红色的线粒体。对于凋亡和死细胞，JC-10中仅单体形式存在，染色胞浆绿色。
  
• 线粒体含有在健康细胞红JC-10的聚集体是可通过使用FL2通道检测，凋亡细胞中绿色JC-10单体是可通过使用FL1通道检测（FITC）。
  
• FL1与FL2荧光强度比值是用来监测通过化合物治疗诱导的线粒体膜电位的变化。
  
  图1.FCCP诱导Jurkat细胞对线粒体膜电位的影响。用JC-10染料处理Jurkat细胞，上面两个为用DMSO做加载溶液处理5分钟，下面两个为5μM FCCP处理10分钟。用BD公司FACS Calibur流式细胞仪的FL1和FL2通道分别测定JC-聚集体和JC-单体，左边两个为未补偿数据，右边两个为补偿数据。